Prioni e malattie da prioni

• Introduzione
• Capitolo 1 Il concetto di prione e l'ipotesi proteica
• Capitolo 2 La proteina prionica cellulare (PrPSc): gene, struttura e funzione
• Capitolo 3 La proteina prionica dello scrapie (PrPSc): aggregazione e propagazione
• Capitolo 4 Ceppi di prioni e barriera di specie
• Capitolo 5 Neuropatologia delle malattie da prioni
• Capitolo 6 Malattie da prioni umane: malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica, genetica e iatrogena.
• Capitolo 7 Kuru: una prospettiva storica sulle encefalopatie spongiformi trasmissibili
• Capitolo 8 Malattie da prioni animali: scrapie in pecore e capre
• Capitolo 9 Encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e il suo potenziale zoonotico
• Capitolo 10 Malattia cronica da depperimento (CWD) nei cervidi
• Capitolo 11 Meccanismi simili ai prioni in altri disturbi neurodegenerativi.
• Capitolo 12 Diagnosi clinica delle malattie da prioni umane.
• Capitolo 13 Tecniche di imaging nella diagnosi delle malattie da prioni.
• Capitolo 14 Biomarcatori nel liquido cerebrospinale e nel sangue.
• Capitolo 15 Amplificazione ciclica del ripiegamento proteico (PMCA) e saggi di conversione indotta da scuotimento in tempo reale (RT-QuIC).
• Capitolo 16 Trasmissione ed epidemiologia delle malattie da prioni
• Capitolo 17 Misure di salute pubblica e sicurezza
• Capitolo 18 Decontaminazione e inattivazione dei prioni
• Capitolo 19 Strategie terapeutiche e sviluppo di farmaci
• Capitolo 20 Immunoterapia per le malattie da prioni
• Capitolo 21 Consulenza genetica e valutazione del rischio nelle malattie da prioni familiari.
• Capitolo 22 Modelli animali nella ricerca sui prioni.
• Capitolo 23 Il ruolo del sistema immunitario nella patogenesi dei prioni.
• Capitolo 24 Prospettive future nella ricerca sui prioni
• Capitolo 25 Implicazioni etiche e sociali delle malattie da prioni

Nel grande e spesso sconcertante teatro della biologia, dove i ruoli degli agenti patogeni sono tradizionalmente interpretati da virus, batteri, funghi e parassiti, un attore nuovo e del tutto inaspettato fece la sua comparsa sulla scena nella seconda metà del XX secolo. Questo protagonista, il prione, sfidava ogni copione noto dell'infezione e dell'ereditarietà. Era un agente di malattia ridotto all'essenziale, un'entità biologica di una semplicità così elegante da sembrare impossibile. Non possedeva DNA, né RNA, né involucro protettivo — nessuno degli accessori genetici che associamo alla vita e alla sua propagazione. Il prione era, con stupore e iniziale incredulità della comunità scientifica, semplicemente una proteina. Non una proteina qualunque, ma una versione mal ripiegata di una proteina già presente nell'organismo, capace di un atto davvero insidioso: indurre le sue controparti normali e benigne ad adottare la sua stessa forma corrotta.

Questo libro è la storia di quella proteina. È un'esplorazione di un principio biologico talmente innovativo da richiedere la riscrittura dei libri di testo e da valere un Premio Nobel al suo scopritore, Stanley B. Prusiner. Egli coniò il termine "prione" nel 1982, una parola macedonia di "proteinaceous infectious particle" (particella infettiva proteica), per descrivere questo agente che era tutto proteina e tutta infezione, un concetto che volava in faccia al dogma centrale della biologia molecolare. La saggezza consolidata era chiara: l'informazione fluisce dagli acidi nucleici alle proteine, non viceversa. Eppure ecco una proteina che sembrava propagarsi da sola, trasmettere una malattia mortale, senza alcuna istruzione genetica. Era un'idea rivoluzionaria e controversa, accolta con notevole scetticamento da un establishment scientifico convinto che un virus nascosto dovesse essere il vero colpevole.

Le malattie causate dai prioni sono strane e terrificanti quanto l'agente stesso. Note collettivamente come encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST), sono invariabilmente disturbi neurodegenerativi fatali che colpiscono sia gli esseri umani che gli animali. Il nome stesso dipinge un quadro cupo: "spongiforme" si riferisce all'aspetto caratteristico del cervello affetto, che si riempie di buchi microscopici, fino a somigliare a una spugna. Questa implacabile distruzione del tessuto cerebrale porta a un declino progressivo delle funzioni, manifestandosi come demenza, perdita di coordinazione e cambiamenti comportamentali. Un marchio distintivo di queste malattie è il loro periodo di incubazione straordinariamente lungo, che può durare anni o persino decenni, durante i quali l'ospite non mostra sintomi mentre si svolge il processo silenzioso e inesorabile di conversione proteica. Ma una volta che i sintomi compaiono, la malattia progredisce con velocità terrificante, portando spesso alla morte nel giro di pochi mesi.

Lo spettro delle malattie da prioni è ampio e inquietante. Nell'uomo, la forma più comune è la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), che tipicamente compare in modo sporadico, con causa ignota, in circa una persona per milione in tutto il mondo ogni anno. Altre forme umane includono la sindrome di Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) e l'insonnia familiare fatale (FFI), che sono ereditarie, risultanti da mutazioni nel gene che codifica per la proteina prionica. Poi c'è il kuru, una malattia che devastò il popolo Fore della Papua Nuova Guinea e fu trasmessa attraverso il cannibalismo rituale, fornendo la prima prova concreta che queste malattie cerebrali umane potessero essere infettive.

Anche gli animali soffrono le loro versioni di questi mali. Lo scrapie, una malattia di pecore e capre riconosciuta sin dal XVIII secolo, fu la prima EST a essere identificata e deve il nome alla tendenza degli animali colpiti a grattarsi compulsivamente la lana contro recinzioni o pali. In tempi più recenti, altre due malattie da prioni degli animali hanno catturato l'attenzione e la preoccupazione del pubblico. L'encefalopatia spongiforme bovina (BSE), o "malattia della mucca pazza", emerse nel Regno Unito negli anni '80, diffondendosi tra i bovini tramite mangimi contaminati. La sua successiva trasmissione all'uomo, causando una nuova malattia battezzata CJD variante (vCJD), scatenò una grave crisi di sanità pubblica, rimodellò le politiche di sicurezza alimentare e rivelò il terrificante potenziale dei prioni di superare la barriera delle specie. In Nord America, la malattia da deperimento cronico (CWD) continua a diffondersi insidiosamente tra le popolazioni di cervi, alci e alci canadesi, sollevando preoccupazioni sul suo potenziale impatto sugli ecosistemi e sui possibili rischi per la salute umana.

Al cuore di tutta questa saga c'è una singola proteina, nota come proteina prionica (PrP). Nella sua forma cellulare normale, indicata come PrP^C, è un componente innocuo, e forse persino utile, delle nostre cellule, in particolare del sistema nervoso, sebbene la sua funzione precisa rimanga in parte enigmatica. Il cattivo della storia è PrP^Sc (chiamata così per lo scrapie), l'isoforma mal ripiegata che causa la malattia. Queste due versioni sono chimicamente identiche, composte dalla stessa identica catena di acidi amino. L'unica differenza risiede nella loro forma tridimensionale, o conformazione. PrP^C è ricca di strutture chiamate alfa-eliche, mentre la patogena PrP^Sc è dominata da foglietti beta.

Questa differenza strutturale è tutto. La PrP^Sc ricca di foglietti beta è incredibilmente stabile e resistente alla degradazione. Mentre le proteine normali vengono costantemente riciclate dalla cellula, PrP^Sc resiste alla demolizione da parte di enzimi chiamati proteasi. Questo le permette di accumularsi, formando aggregati e lunghe fibrille amiloidi che sono tossiche per i neuroni e portano al caratteristico danno spongiforme. Crucialmente, PrP^Sc agisce come un modello. Quando incontra una molecola di PrP^C normale, induce in qualche modo la proteina sana ad abbandonare la sua forma normale e a ripiegarsi nella pericolosa conformazione PrP^Sc. Questo innesca una reazione a catena, una cascata lenta ma inesorabile di malripiegamento che si propaga da una proteina all'altra, fino a sopraffare il cervello.

L'esistenza dei prioni ha forzato una completa rivalutazione di ciò che costituisce un agente infettivo. A differenza di virus o batteri, i prioni sono sbalorditivamente resistenti ai metodi che normalmente distruggerebbero i patogeni. Possono resistere all'ebollizione, ai disinfettanti convenzionali e persino a livelli di radiazioni che oblitterebbero il DNA o l'RNA virale. Questa incredibile robustezza pone sfide profonde per la sanità pubblica, dalla sterilizzazione degli strumenti chirurgici alla sicurezza delle trasfusioni di sangue e dei trapianti d'organo. La trasmissione iatrogena della CJD attraverso strumenti neurochirurgici contaminati o preparati di ormone della crescita umano derivati da individui deceduti serve come monito severo di questi rischi.

Una delle implicazioni più profonde e di vasta portata della ricerca sui prioni si estende ben oltre le rare EST. Gli scienziati hanno riconosciuto che il meccanismo di una proteina mal ripiegata che innesca una cascata di ulteriori malripiegamenti non è unico alle malattie da prioni. Questo meccanismo "simil-prionico" si ritiene ora svolga un ruolo fondamentale in una serie di disturbi neurodegenerativi più comuni e devastanti. Le placche di proteina amiloide-beta e i grovigli di proteina tau che caratterizzano la malattia di Alzheimer, e i corpi di Lewy composti da alfa-sinucleina che si trovano nella malattia di Parkinson, sembrano tutti diffondersi nel cervello in una modalità simile, auto-propagantesi. Sebbene queste malattie non siano considerate infettive nello stesso modo della CJD o del kuru, comprendere il paradigma del prione offre una potente nuova lente attraverso cui osservarne la patologia e un promettente viale per sviluppare nuove strategie terapeutiche.

Questo libro mira a guidarvi attraverso questo mondo complesso e affascinante. Inizieremo addentrandoci nel nucleo del concetto di prione, esplorando l'ipotesi della sola proteina e la struttura e funzione delle proteine prioniche normali e patologiche. Intraprenderemo poi un viaggio attraverso l'intero panorama delle malattie da prioni umane e animali, dalla curiosità storica del kuru alla sfida in corso della malattia da deperimento cronico. I capitoli successivi sposteranno l'attenzione sulle praticità di vivere in un mondo dove esistono i prioni. Esamineremo la diagnosi clinica di queste malattie elusive, osservando le avanzate tecniche di imaging e gli assay di biomarcatori che offrono speranza per una diagnosi precoce. Affronteremo le questioni di sanità pubblica, inclusa l'epidemiologia, la trasmissione e l'importanza cruciale della decontaminazione. Infine, volgeremo lo sguardo al futuro, esaminando lo stato attuale dello sviluppo terapeutico, dall'immunoterapia alla scoperta di farmaci, e contemplando le dimensioni etiche e sociali di queste malattie uniche.

La storia dei prioni è il racconto di un'eresia scientifica che diventa fatto consolidato. È la storia di un patogeno che è contemporaneamente parte di noi e un implacabile invasore straniero, un Jekyll e Hyde molecolare. È una cruda illustrazione di come un sottile cambiamento nella forma di una proteina possa scatenare una cascata di distruzione, un processo che non è solo centrale per un gruppo di malattie rare e spaventose, ma potrebbe anche custodire la chiave per comprendere alcuni dei flagelli neurologici più comuni dell'umanità.

La storia del prione è una lezione magistrale di rivoluzione scientifica, una narrazione di come un'idea singola e audace possa sovvertire decenni di dogma biologico consolidato. Ha inizio non in un luccicante laboratorio moderno, ma nei campi spazzati dal vento dell'Europa del XVIII secolo, dove i pastori osservavano una strana e fatale malattia nei loro greggi. La chiamarono scrapie, un nome che coglieva vividamente il sintomo principale: un prurito agonizzante che costringeva le pecore a grattarsi via il vello contro qualsiasi cosa trovassero. La malattia era inesorabilmente progressiva, portava a tremori, barcollamenti e, infine, alla morte. Per secoli fu una curiosità veterinaria, la sua causa un mistero completo. Nel XX secolo, gli scienziati avevano stabilito che la scrapie era trasmissibile, ma la natura dell'agente infettivo era profondamente sconcertante.

Le prime indagini sulla scrapie e sulle malattie umane correlate, come il kuru e la malattia di Creutzfeldt-Jakob, erano inquadrate dalla virologia dell'epoca. I lunghi periodi di incubazione, che duravano talvolta anni o addirittura decenni, portarono lo scienziato islandese Björn Sigurðsson a coniare il termine "virus lento" negli anni '50. Era una spiegazione plausibile e confortevole. Si adattava alla tempistica delle malattie e invocava una classe nota di patogeno. L'unico problema era che nessuno riusciva a trovare il virus. Nonostante gli intensi sforzi, non era possibile isolare particelle virali dai cervelli di animali o esseri umani colpiti. Inoltre, l'agente responsabile di queste encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) mostrava una resistenza bizzarra e quasi soprannaturale a trattamenti che avrebbero dovuto obliterare qualsiasi patogeno convenzionale. Sopravviveva all'ebollizione, alla formaldeide e ad altri disinfettanti aggressivi. Era un enigma che suggeriva qualcosa di completamente nuovo.

La prima grande crepa nella teoria del "virus lento" venne da una serie di esperimenti eleganti condotti negli anni '60 da una radiobiologa di base a Londra, Tikvah Alper. Alper e i suoi colleghi presero campioni di tessuto cerebrale infetto da scrapie e li bombardarono con radiazioni ionizzanti e ultraviolette (UV). Ragionavano che questo avrebbe permesso loro di dedurre le dimensioni e la natura dell'agente infettivo. I risultati furono sorprendenti. L'agente della scrapie era straordinariamente resistente alle radiazioni ionizzanti, suggerendo che fosse incredibilmente piccolo, forse troppo piccolo per essere un virus. Ancora più rivelatrice fu la sua reazione alla luce UV. La radiazione UV a una lunghezza d'onda di 260 nanometri è particolarmente efficace nel danneggiare gli acidi nucleici (DNA e RNA), le fondamenta genetiche di tutte le forme di vita note, inclusi i virus. Eppure, questa specifica lunghezza d'onda aveva un effetto sorprendentemente scarso sulla capacità dell'agente della scrapie di trasmettere la malattia. Era, come disse Alper, effettivamente trasparente all'UV germicida. Era un indizio profondo che l'agente potesse non possedere affatto un genoma a base di acidi nucleici.

All'incirca nello stesso periodo, il ricercatore veterinario Iain Pattison presso il Consiglio per la Ricerca Agricola britannico stava intaccando la saggezza convenzionale. Dimostrò che la scrapie poteva essere trasmessa attraverso estratti cerebrali parzialmente purificati e notò l'incredibile tenacia dell'agente, che sopravviveva a trattamenti che avrebbero distrutto i virus. In quella che fu una suggestione notevolmente preveggente, seppur forse leggermente ironica, ipotizzò che l'agente potesse essere qualcosa di diverso da un virus, magari anche un polisaccaride auto-replicante. L'idea chiave era che l'infettività sembrava inestricabilmente legata a una componente proteica dell'ospite stesso. Le prove si accumulavano: l'agente della scrapie era piccolo, era resistente e sembrava sfidare la regola fondamentale secondo cui la vita richiede geni per replicarsi.

Questa era la situazione quando un giovane neurologo americano di nome Stanley Prusiner entrò nel campo nel 1972. Il suo interesse fu acceso da un paziente che stava curando, che stava morendo di malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), un'encefalopatia spongiforme umana. Affascinato e turbato dalla natura misteriosa della malattia del suo paziente, Prusiner dedicò la sua carriera a isolare e identificare l'agente infettivo. Fondò un laboratorio all'Università della California, San Francisco, e intraprese quello che sarebbe diventato uno sforzo decennale, meticoloso e faticoso, per purificare l'agente della scrapie dai cervelli di migliaia di criceti infetti.

L'impresa era monumentale. Prusiner e il suo team dovettero sviluppare un bioassay più efficiente per misurare l'infettività — essenzialmente, cronometrare quanto tempo impiegavano i criceti a sviluppare sintomi dopo essere stati inoculati con frazioni cerebrali progressivamente più purificate. Questo bioassay, sebbene lento e laborioso, fu la bussola cruciale che guidò la loro ricerca biochimica. Sottoposero il materiale infettivo a una batteria di trattamenti, monitorando meticolosamente quali procedure riducevano la sua capacità di causare malattia.

Più e più volte, i risultati puntavano in una sola direzione. Le procedure note per degradare o distruggere le proteine, come il trattamento con enzimi chiamati proteasi o con certi detergenti, riducevano costantemente l'infettività dei campioni. Al contrario, i trattamenti progettati per distruggere gli acidi nucleici, incluse varie nucleasi e l'esposizione a ioni zinco, non avevano alcun effetto. La conclusione, per quanto radicale, stava diventando ineluttabile. L'agente infettivo non era un virus, un batterio o qualsiasi altra forma di vita convenzionale. La sua infettività dipendeva dalla proteina.

In un articolo fondamentale pubblicato nel 1982 sulla rivista Science, Prusiner propose un nome per questo nuovo patogeno e un'ipotesi per spiegarne l'esistenza. Coniò il termine "prione", una parola macedonia di "proteinaceous infectious particle" (particella infettiva proteinacea), per distinguerlo da virus e viroidi (che sono molecole di RNA infettive). Il nome era accattivante, controverso e destinato a restare. Lo pronunciò deliberatamente "pree-on" per differenziarlo dal nome di un uccello marino. Ancora più importante, articolò formalmente l'"ipotesi della sola proteina". Questa ipotesi proponeva che il prione fosse una forma aberrante di una proteina normale in grado di auto-replicarsi in assenza di qualsiasi acido nucleico.

L'ipotesi della sola proteina fu un'eresia scientifica. Volava in faccia al dogma centrale della biologia molecolare, secondo cui l'informazione genetica fluisce dagli acidi nucleici alle proteine, e mai nel verso opposto. L'idea che una proteina potesse agire come agente infettivo, trasportando informazione e costringendo altre proteine a copiarne la forma, fu vista da molti come assurda. La comunità scientifica reagì con scetticismo intenso e, in molti casi, aperta ostilità. Prusiner fu criticato per aver coniato un nuovo termine per un agente che non aveva ancora completamente purificato. Molti ricercatori affermati nel campo rimasero convinti che un "virus lento" nascosto fosse ancora il vero colpevole e che la proteina di Prusiner fosse semplicemente un sottoprodotto patologico dell'infezione, non la sua causa.

Nonostante la reazione contraria, l'ipotesi della sola proteina faceva una previsione chiara e verificabile. Se il prione era davvero una versione mal ripiegata di una proteina normale dell'ospite, allora un gene per quella proteina doveva esistere nel genoma dell'ospite stesso. Una ricerca fu avviata dal gruppo di Prusiner e da altri laboratori, in particolare quello del biologo molecolare Charles Weissmann. Nel 1985, fecero centro. Identificarono e clonarono con successo il gene che codifica per la proteina prionica (ora nota come PRNP negli esseri umani). La scoperta decisiva fu che questo gene era presente non solo negli animali infetti da scrapie, ma anche in animali e esseri umani sani e non infetti.

Fu un momento cruciale. L'agente infettivo non era un invasore estraneo con i suoi geni unici. Invece, il problema risiedeva in una delle proteine stesse del corpo. Questa scoperta permise agli scienziati di distinguere finalmente tra le due versioni della proteina. La forma normale e sana, presente sulla superficie delle cellule (in particolare dei neuroni), fu designata PrP^C (Proteina Prionica Cellulare). L'isoforma infettiva, causa della malattia, fu chiamata PrP^Sc (Proteina Prionica della Scrapie).

Con il gene in mano, i ricercatori poterono iniziare a caratterizzare le differenze tra le due proteine. Chimicamente, erano identiche, composte dalla stessa identica sequenza di acidi amino. La differenza era interamente conformazionale — una divergenza nella loro forma tridimensionale ripiegata. La PrP^C è prevalentemente composta da strutture flessibili e ad anello chiamate alfa-eliche. La patogena PrP^Sc, in netto contrasto, è costituita in gran parte da strutture rigide e appiattite note come foglietti beta. Questo cambiamento strutturale altera drasticamente le proprietà della proteina. Mentre la PrP^C è solubile nei detergenti e facilmente spezzata dalle proteasi, la PrP^Sc è insolubile e ostinatamente resistente alla digestione proteasica. Questa resistenza alle proteasi sarebbe diventata un marcatore biochimico critico per rilevare la presenza dell'isoforma patogena nei campioni di tessuto.

La prova finale e definitiva per l'ipotesi della sola proteina venne dal nascente campo dell'ingegneria genetica. Il laboratorio di Charles Weissmann prese l'iniziativa in un esperimento fondamentale. Crearono topi transgenici in cui il gene PRNP era stato completamente rimosso, o "eliminato" (knocked out). Questi topi knockout per la PrP erano anatomicamente normali e sani, suggerendo che la proteina prionica non era essenziale per la sopravvivenza di base, almeno in un contesto di laboratorio. Il test cruciale arrivò quando questi topi knockout furono iniettati con una dose potente di PrP^Sc infettiva. Il risultato fu inequivocabile: i topi non si ammalarono. Erano completamente resistenti alla scrapie e non propagarono alcun prione nei loro cervelli. Questo dimostrò, al di là di ogni ragionevole dubbio, che la PrP^C dell'ospite era assolutamente necessaria perché la malattia si sviluppasse. La PrP^Sc infettiva aveva bisogno di una fornitura di PrP^C normale da convertire.

Ulteriori esperimenti cementarono questa conclusione. Quando tessuto cerebrale normale contenente PrP^C fu trapiantato nei cervelli di topi knockout, solo il tessuto trapiantato poté essere infettato e distrutto dai prioni; il tessuto cerebrale circostante, privo di PrP, rimase intatto. Questo dimostrò che l'espressione di PrP^C era richiesta per gli effetti tossici dei prioni sui neuroni. Le prove erano ormai schiaccianti: l'informazione genetica per il prione era codificata in un gene dell'ospite, e la diffusione della malattia dipendeva dalla presenza della proteina dell'ospite.

Tuttavia, una sfida finale rimaneva per l'ipotesi della sola proteina, un'impresa spesso definita il "santo graal" della ricerca sui prioni: creare prioni infettivi in una provetta usando solo componenti proteici puri e sintetici. Questo avrebbe eliminato qualsiasi possibilità che un acido nucleico virale nascosto e contaminante fosse responsabile dell'infettività. I primi tentativi fallirono, ma nei primi anni 2000, diversi gruppi, incluso quello di Prusiner, riuscirono finalmente nell'impresa. Furono in grado di prendere la proteina prionica ricombinante, prodotta in batteri, e sottoporla a condizioni che la portavano a malripiegarsi nello stato aggregato, ricco di foglietti beta, della PrP^Sc. Quando questo materiale puramente sintetico fu iniettato negli animali, produsse una malattia neurodegenerativa fatale e trasmissibile.

Questi studi di propagazione in vitro, in particolare quelli che utilizzavano tecniche come l'Amplificazione Ciclica del Malripiegamento Proteico (PMCA), soddisfacevano formalmente una versione moderna dei postulati di Koch per un agente a base proteica. Era ora possibile generare l'agente infettivo da componenti definiti e minimali, dimostrando che la conformazione di una proteina da sola poteva essere patogena e infettiva. Il dibattito durato decenni era effettivamente risolto.

Nel 1997, Stanley Prusiner ricevette il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina per la sua scoperta dei "prioni — un nuovo principio biologico di infezione". Fu una rivendicazione per una teoria che era stata respinta come eretica e per uno scienziato che aveva resistito per anni a scetticismo e controversie. Il viaggio da una strana malattia delle pecore alla validazione di un concetto rivoluzionario aveva rimodellato la nostra comprensione dell'infezione, dell'ereditarietà e della natura fondamentale della malattia stessa.